仓鼠经口给予亚砷酸盐后血浆中砷结合蛋白的纯化
1．4用凝胶过滤和阴离子交换柱层析方法纯化亚砷酸结合蛋白基于紫外检测器在280nm处的吸光度检测蛋白(Shimadzu，Kyoto，Japan)。第一步，将仓鼠血浆内As-BP以0．6ml/min的速率用Tris-HNO3缓冲液从凝胶过滤KW柱洗脱，收集保留时间为13～15min。第二步，将凝胶过滤柱得到的馏分用AmiconUltra-15(Millipore，10kD)脱盐和浓缩，用ES520阴离子交换柱以1，3-二氨基丙烷线性浓度梯度洗脱分离蛋白(pH9．0)。接着，将最初的5min调整为用浓盐酸1，3-二氨基丙烷(pH9．0，温度25℃)洗脱，15min内用线性浓度梯度的0%缓冲液A到100%缓冲液B［200mmol/L的1，3-二氨基丙烷(pH9.0，温度25℃)］，再用100%缓冲液B洗脱15min(流速1．0ml/min)。收集保留时间为16～18min，砷结合蛋白片段通过AmiconUltra-15离心过滤装置浓缩并脱盐。第三步，浓缩片段再次加入到KW-803色谱柱里洗脱。
1．5SDS-PAGE分析在不同分离过程中收集到的每个蛋白样本(1μg蛋白/样本)通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分离，即先将蛋白样本用4．75%浓缩胶浓缩，然后经10%～15%分离胶按分子量大小进行分离。蛋白条带通过银染色检测，扫描和脱色后，进行胰蛋白酶消化。
1．6基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)分析电泳结束后考马斯亮蓝染色，目的蛋白的回收采用电洗脱，用刀片切取胶上差异蛋白点，放入Eppendorf管，进行胶内酶解，Trypsin冰上吸胀45min，37℃酶解16h，水溶液(35%、65%、100%乙腈，0．1%TFA)超声3次，真空冷冻浓缩至10μl，取样品进行点靶上样。通过NCBI蛋白质序列数据库(http://www．matrixscience．com)进行检索。
2结果
2．1单次经口给予三价砷后仓鼠血浆中砷分布与时间依赖关系利用凝胶过滤柱GS220柱测定了仓鼠血浆中的砷结合蛋白，追踪1d至5d仓鼠血浆内的砷结合蛋白。经口给予亚砷酸(iAsⅢ)后第1天，可清楚地检测到砷结合蛋白(保留时间9．2min);给药后第3天，砷结合蛋白明显减少接近于对照组(图1)，这表明在仓鼠血液中结合蛋白质的砷可能从砷结合蛋白中游离了出来。